在建立一個(gè)分析方法時(shí)，我們重點(diǎn)關(guān)注的就是峰形、分離度和靈敏度。那么，影響峰形、分離度和靈敏度的因素有哪些？如何改善待分析物峰形，增大分離度，提高靈敏度呢？

01、分離模式

了解樣品的主要性質(zhì)，是選擇分離模式的關(guān)鍵。針對特定的分析物，選擇合適的分離模式，是進(jìn)行有效色譜分離的首要問(wèn)題。

02、固定相

色譜柱的選擇是建立液相色譜方法時(shí)必須考慮的問(wèn)題，選對色譜柱往往可以實(shí)現事半功倍的效果。常用的色譜柱主要有C18、C8、苯基柱、氰基柱、氨基柱、離子交換柱等。

C18柱是方法篩選時(shí)更常用的色譜柱，對于疏水性較強（LogD＞0）的待分析物往往有很好的保留。C8和C4柱等是保留能力稍弱于C18的經(jīng)典反相色譜柱。另外，根據待分析物分子量、流動(dòng)相中水相比例、pH等的差異，可以選擇不同類(lèi)型的色譜柱。

月旭色譜中選擇指南

苯基柱和五氟苯基柱存在中等強度的疏水相互作用和強π-π相互作用，五氟苯基柱還存在強的偶極作用，對于芳香族化合物，特別是苯環(huán)上的位置異構體，常規C18無(wú)法通過(guò)疏水相互作用將其有效分離，苯基柱可以通過(guò)它們之間的π-π相互作用差異實(shí)現分離。

對于C18上沒(méi)有保留的化合物，氰基鍵合相是個(gè)很不錯的選擇。氰基鍵合相在正相和反相模式中均可以使用。在反相色譜中，氰基的疏水性相對較弱，且由于具有π-電子作用，適用于C18柱保留較弱的樣品。在正相色譜中，氰基的極性相對更弱，是保留能力更小的正相吸附劑。

氨基柱可用于正相、反相和弱陰離子交換，在反相條件下特別適合分析糖類(lèi)物質(zhì)，在正相條件下可用于分析一些溶于烷烴、烯烴和芳香烴的有機化合物，在低pH緩沖液中能分離帶負電荷的分子。

03、流動(dòng)相

流動(dòng)相的選擇和比例調整是開(kāi)發(fā)方法更重要的環(huán)節，很多時(shí)候分離度不好、峰形差的問(wèn)題都可以通過(guò)調整流動(dòng)相來(lái)解決。流動(dòng)相的選一般遵循由強到弱，先粗調再微調的思路。

由強到弱：即首先選擇強洗脫條件，以快速得到分離結果，然后再根據出峰情況調整流動(dòng)相比例。

先粗調再微調：當分離達到一定程度，對流動(dòng)相的比例、緩沖鹽pH等條件的調整就要做的更加精細，以?xún)?yōu)化得到更佳分離條件。

04、柱溫

柱溫對保留時(shí)間、柱壓和峰形都有一定的影響。一般來(lái)說(shuō)，升高柱溫，保留時(shí)間縮短，柱壓降低。但有時(shí)也會(huì )出現保留時(shí)間隨柱溫升高而延長(cháng)的情況，特別是用鍵合極性基團的反相柱分離一些極性化合物的時(shí)候。

對于一些拖尾較嚴重的化合物，適當升高柱溫，可以有效改善峰形和柱效。對于大分子的分析，尤其是運行流速較高時(shí)，適當升高柱溫，可以降低柱壓、改善柱效。在手性分離中，一般則是低柱溫有利于提高分離度。

柱溫對峰面積的影響一般不怎么明顯，只有部分離子化合物在不同溫度下的電離程度不同，吸收波長(cháng)和吸收強度會(huì )隨之發(fā)生變化，從而影響峰面積大小。

05、溶劑

一般情況下，溶劑對峰形的影響比較小，但是對于一些峰分叉、拖尾等異常色譜行為，也要考慮到溶劑效應的影響。特別是在溶解樣品的溶劑強度大于該樣品出峰時(shí)流動(dòng)相強度時(shí)，容易出現色譜峰的展寬或者分叉（反相色譜中的溶劑強度順序為水＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜四氫呋喃＜丙醇＜二氯甲烷）。

另外，在進(jìn)樣體積較大或溶劑和流動(dòng)相兼容性差時(shí)，也容易導致峰形問(wèn)題，甚至是保留時(shí)間差異。溶劑和流動(dòng)相的pH差異有時(shí)候會(huì )引起化合物電離狀態(tài)的變化，也會(huì )引起峰形和保留時(shí)間問(wèn)題。