反相色譜柱中使用更多的就是硅膠基質(zhì)色譜柱。硅膠基質(zhì)的表面有許多殘留的硅醇基，圖1顯示了硅醇基可能存在的多種形式。在弱酸性環(huán)境中，這些硅醇基能和特定的化合物和基質(zhì)成分特別是堿性化合物發(fā)生相互作用，導致堿性化合物吸附于硅膠表面。同時(shí)，硅膠中殘留的重金屬離子會(huì )將酸性更強的物質(zhì)引入到硅膠表面中。另外，硅膠也會(huì )與金屬螯合物或清潔劑發(fā)生相互作用。

例如，像玉米油，gai級芳香化合物和蠟這樣的樣品基質(zhì)會(huì )粘附在反相填料表面并改變其性質(zhì)，含有蛋白質(zhì)成分的生物樣品也會(huì )吸附在填料顆粒表面，即使采用樣品前處理的方法來(lái)避免外來(lái)物質(zhì)的污染以保護色譜柱，更終待測物的基質(zhì)仍然會(huì )吸附在色譜柱表面。色譜柱在被污染后的色譜行為會(huì )不同于未被污染的色譜柱。

通常樣品基質(zhì)中會(huì )含有一些與目標分析物無(wú)關(guān)的污染物。比如鹽，酯類(lèi)，脂肪族化合物，有機酸，疏水性蛋白和其他生物組分，這些都是可能與固定相發(fā)生相互作用的物質(zhì)。與目標分析物相比，這些污染物的保留能力可能更強。一旦這些預料之外的污染物被檢測器檢測到，在色譜圖上則表現為色譜峰分叉，基線(xiàn)波動(dòng)甚至是負峰。

如果污染物在色譜柱上的保留能力很強，流動(dòng)相的洗脫能力不足以將這些污染物沖出來(lái)，那么在多次進(jìn)樣后，這些吸附在色譜柱上的污染物就會(huì )聚集。當污染物積累足夠多時(shí)，它們就會(huì )像改性填料一樣表現出相應的性質(zhì)，目標分析物與這些污染物的相互作用會(huì )影響其原本的分離機制，導致保留時(shí)間波動(dòng)和峰拖尾。如果污染物更多，則柱壓可能升至很高的水平，甚至超過(guò)柱壓上限。

叁·沖洗反相色譜柱

月旭色譜柱推薦正向使用，反向沖洗。

由于絕大多數保留能力強的污染物通常位于色譜柱柱頭端，因此反沖色譜柱可以大大縮短污染物離開(kāi)色譜柱需經(jīng)過(guò)的距離。月旭色譜柱兩端所用篩板孔徑一致，不會(huì )出現反沖時(shí)將填料沖出的問(wèn)題。大多數現代不銹鋼色譜柱是在比日常使用壓力更高的壓力條件下充填的，因此在反沖時(shí)柱床通常不會(huì )受到影響。

對反相柱進(jìn)行柱清洗的頻率取決于強保留性物質(zhì)進(jìn)入到色譜柱的多少。由于反相色譜柱在表現出分離度下降或釋放異常物質(zhì)之前能夠耐受較大程度的污染，因此用戶(hù)通常等觀(guān)察到色譜柱異常后才會(huì )進(jìn)行沖洗，但是污染物的堆積會(huì )使清洗工作變得更為困難?；谶@個(gè)原因，如果有的樣品基質(zhì)比較復雜，建議定期對色譜柱進(jìn)行沖洗。對色譜柱沖洗的頻率越高，所需的沖洗程序也就越簡(jiǎn)單。

（當色譜柱出現柱壓升高、峰型異常、柱效下降、分離度下降）

肆·沖洗反相色譜柱的殘留蛋白質(zhì)

如果污染物是生物類(lèi)，比如血漿，血清，蛋白質(zhì)和多肽在反相色譜柱上聚集，通常乙腈或甲醇這樣的純有機溶劑難以溶解這些污染物。然而，有機溶劑與緩沖鹽、酸或者離子對試劑混合溶劑能沖洗掉生物類(lèi)污染物。

如果色譜柱被生物類(lèi)樣品污染，推薦使用乙腈：水：三氟乙酸 （50/50/0.1）為流動(dòng)相，在做樣流速下反向沖洗60倍柱體積，并在進(jìn)樣前用初始流動(dòng)相對色譜柱進(jìn)行平衡，那么色譜柱對生物類(lèi)樣品的分離能力就可以恢復。

各位小伙伴如果想了解更多有關(guān)高效液相色譜柱的清洗與再生的相關(guān)信息，請咨詢(xún)月旭當地銷(xiāo)售人員或撥打400-810-6969垂詢(xún)。